🧬 Proyecto Flagship · CAR-T Cell Therapy · México

Desarrollo In-House de
Vector Lentiviral CD19 CAR-T

Programa pionero de manufactura descentralizada en México · Fase RUO → Validación clínica

✅ Fase: RUO · Preclínico 🏥 Monterrey, México 🎯 Indicación: LLA-B r/r ⚙️ cGMP · ISO 7 🔬 2ª Generación · 4-1BB/CD3ζ

Programa estratégico de manufactura interna de células CAR-T anti-CD19, orientado al estudio preclínico de la leucemia linfoblástica aguda de precursores B refractaria o en recaída. La iniciativa busca establecer soberanía tecnológica en terapias de células CAR-T en México, con una ruta definida hacia la validación clínica bajo estándares regulatorios nacionales e internacionales.

10,053

bp · Tamaño del constructo (versión preclínica)

>10⁸

TU/mL · Título garantizado del vector

ISO 7

Clasificación del cuarto limpio de manufactura

2 Gen

Generación del constructo CAR · 4-1BB + CD3ζ

    
    Arquitectura del Constructo CAR Anti-CD19
  

🔒

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Dos Versiones del Constructo

Versión Preclínica

Con cassette CMV-EGFP

Incluye proteína fluorescente verde (EGFP) como reportero para cuantificación de eficiencia de transducción por citometría de flujo y seguimiento celular en modelos murinos. Exclusivo para uso en investigación (RUO).

10,053 bp · Uso: validación preclínica

Candidato Clínico

Sin cassette reportero

Arquitectura depurada del mismo constructo CAR, sin genes reporteros de origen no humano. Compatible con requisitos regulatorios para futuros ensayos clínicos. Elimina el riesgo de respuesta inmune contra EGFP en pacientes.

8,699 bp · Objetivo: uso clínico futuro

Arquitectura del Constructo — 4 Módulos

01 · DISEÑO

Constructo CAR

Ingeniería del receptor quimérico anti-CD19

Promotor EF1A — Actividad transcripcional constitutiva y robusta en linfocitos T. Mayor resistencia al silenciamiento epigenético comparado con CMV, favoreciendo expresión estable a largo plazo.

scFv Anti-CD19 · clon FMC63 — Dominio de reconocimiento antigénico. Mismo clon utilizado en Kymriah® (tisagenlecleucel) y Yescarta® (axicabtagene ciloleucel). Orientación VL-VH con linker flexible de 16 aminoácidos.

Bisagra · TM CD8α — Región bisagra y dominio transmembrana de CD8α. Provee flexibilidad conformacional y reduce el riesgo de dimerización espontánea y activación tónica no antígeno-dependiente.

Coestimulador 4-1BB (CD137) — Activa vías NF-κB y PI3K/Akt. Promueve diferenciación hacia fenotipos de memoria central (Tcm) y menor agotamiento celular respecto a CD28. Base de tisagenlecleucel.

Activación CD3ζ — Dominio de activación primaria con 3 ITAMs. Responsable de la transducción de la señal citotóxica tras el reconocimiento antigénico.

oPRE Elemento regulador postranscripcional optimizado (versión truncada del WPRE). Mejora estabilidad del ARNm y eficiencia de exportación nuclear. Deleción del ORF-X para eliminar potencial oncogénico.

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02 · VECTOR

Lentiviral VSV-G

Producción, titulación funcional y optimización de MOI

Pseudotipo VSV-G — Glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular. Confiere amplio tropismo celular y alta eficiencia de transducción en linfocitos T primarios pre-activados. Estándar en manufactura CAR-T aprobada por FDA.

Configuración SIN (Self-Inactivating) — Deleción de la región U3 en ambos LTRs (ΔU3). Elimina actividad promotora viral tras integración, reduciendo significativamente el riesgo de mutagénesis insercional.

Elementos Señal de empaquetamiento Ψ + elemento de respuesta a Rev (RRE) + tracto de polipurina central (cPPT). Garantizan integración eficiente y título viral adecuado (>10⁸ TU/mL).

MOI objetivo Rango evaluado: MOI 2, 5 y 10 en linfocitos T primarios. Respaldado por evidencia de que MOI 5 representa el punto de mayor eficiencia clínica para vectores lentivirales con CAR anti-CD19.

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03 · MANUFACTURA

Proceso cGMP

Activación, transducción y expansión de células T

Material PBMCs de donadores sanos por gradiente Ficoll-Paque. Selección negativa de linfocitos T CD4+/CD8+ (≥80% pureza CD3+). Verificación por citometría de flujo pre-proceso.

Activación T Cell TransAct (Miltenyi) — Reactivo estándar para activación de linfocitos T primarios. 1×10⁶ células/mL en TexMACS GMP + IL-7 (12.5 ng/mL) + IL-15 (12.5 ng/mL) + HSA 3%.

Transducción 14–18 horas post-activación (Día 1). Placa 24 pozos, 1 mL/pozo, 1×10⁶ células/pozo. Polybrene 6 µg/mL como agente policatiónico potenciador.

Expansión Días 6–12: transferencia a frasco T-25, densidad 1×10⁶ células/mL, IL-2 (100 UI/mL) cada 72 horas. Cuarto limpio ISO 7 con monitoreo continuo.

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04 · CALIDAD

QC · Criopreservación

Control microbiológico, BACTEC™ y estabilidad

Criterios ≥80% viabilidad CD3+ · ≥10% CAR-T entre CD3+ viables · ≥80% CD3+ entre CD45+ viables. Basados en estándares internacionales para manufactura CAR-T.

Citometría Panel fenotípico completo por citometría de flujo. Cuantificación CAR+ por marcador específico y (en versión preclínica) detección directa EGFP en canal FITC para correlación de métodos.

Microbiología BACTEC™ FOS — Control microbiológico con detección de contaminantes en matrices DMSO/HSA. Criterio: resultado negativo obligatorio.

Funcional Citotoxicidad vs Raji CD19+ (E:T 1:1, 5:1, 10:1) · ≥50% lisis a E:T 5:1. Producción IFN-γ ≥500 pg/mL en co-cultivo CD19+. Endotoxinas <5 EU/mL.

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Características de Seguridad del Vector

🛡️ Elementos de seguridad incorporados

Configuración SIN (Self-Inactivating) — deleción ΔU3 en ambos LTRs elimina actividad promotora viral post-integración, reduciendo mutagénesis insercional.
Dominios CD8α para bisagra y transmembrana — menor riesgo de dimerización espontánea y activación tónica no antígeno-dependiente vs IgG4.
oPRE optimizado — deleción del ORF-X del WPRE original elimina el potencial oncogénico reportado, manteniendo el beneficio de estabilidad del ARNm.
Dominio coestimulador 4-1BB — menor riesgo de agotamiento celular y perfil de toxicidad más favorable que CD28 en uso clínico.
Clasificación NBS-2 — manejo en cuarto limpio ISO 7 con protocolos de bioseguridad conforme a NOM-087-ECOL-SSA1-2002.
Candidato clínico sin EGFP — elimina riesgo de respuesta inmune contra proteína fluorescente de origen no humano en pacientes.

Contexto y Justificación

Los productos CAR-T aprobados (Kymriah®, Yescarta®, Breyanzi®) han demostrado tasas de remisión completa superiores al 70–90% en LLA-B pediátrica y adulta refractaria. Sin embargo, en México el acceso enfrenta barreras críticas: tiempos logísticos de 3–6 semanas desde leucoféresis hasta infusión, complejidades regulatorias de importación de ATMPs, y costos que superan el umbral de cualquier sistema de salud pública en la región.

La iniciativa cuenta con infraestructura especializada: cuarto limpio ISO 7, citometría multiparamétrica validada y equipo con formación en hematología oncológica, biología molecular y control de calidad. Esta base hace técnicamente viable un programa in-house de vector lentiviral anti-CD19 bajo estándares RUO, con ruta definida hacia validación clínica, en coherencia con recomendaciones internacionales sobre desarrollo descentralizado de terapias CAR-T para entornos de recursos limitados.

Objetivos Estratégicos

01

Validación preclínica in vitro e in vivo

Demostrar eficacia y seguridad funcional en células T primarias y modelo murino NSG con xenoinjerto Raji, generando expediente para solicitud regulatoria ante COFEPRIS.

02

Adaptación a manufactura mini-escala

Protocolo manual en placa 24 pozos bajo cuarto limpio ISO 7, manteniendo criterios de calidad validados internacionalmente (≥80% viabilidad, ≥10% CAR-T).

03

Capacidad de manufactura interna de vector

Producción propia mediante sistema de tres plásmidos en HEK293T, purificación por ultracentrifugación y QC bajo ISO 5. Eliminación de dependencia de proveedores externos.

04

Soberanía tecnológica y propiedad intelectual

Documentación para registros IMPI sobre procesos optimizados en contexto institucional. Posicionamiento del HU UANL como centro de referencia regional con capacidad de transferencia tecnológica.

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🛡️ Elementos de seguridad incorporados

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